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慢性病毒转导初学者指南

在过去的20年中,使用病毒传递系统转导细胞进行基因和蛋白质研究已经变得非常突出。特别是,使用慢病毒载体可以稳定表达您感兴趣的基因。只需一点核酸魔法就可以实现这一切。

慢病毒(一种逆转录病毒属)表达逆转录酶,其将病毒RNA转化为双链DNA,以及整合酶,其将该病毒DNA插入宿主DNA中。一旦病毒DNA整合到宿主DNA中,它就会与宿主细胞一起分裂,而且没有一个是明智的。逆转录病毒和慢病毒之间的主要区别在于逆转录病毒仅感染分裂细胞,而慢病毒感染分裂细胞和非分裂细胞1,因此可以感染有丝分裂后细胞,如神经元2。

实验设计

正如我们从微生物学课程中所记得的那样,病毒需要细胞“存活”,因为它们缺乏复制机制以产生更多的基因组拷贝。因此,慢病毒载体传递系统实验的最重要方面之一是慢病毒载体的实际产生,其通常发生在HEK293细胞(或某些品种)中。

例如,慢病毒递送系统的一个常见用途是插入用于RNAi介导的基因敲除的短发夹RNA(shRNA)。在这种情况下,首先将shRNA包装到慢病毒载体中,然后用于转染HEK293细胞。使这些转染的细胞孵育约3天,这允许慢病毒复制并产生慢病毒颗粒,然后收获,滴定并用于转导靶细胞。

在开始任何实验之前,最好提前计划并订购所有必需的组件。对于转染和转导实验,您将需要用于maxiprep / midiprep的试剂,用于培养HEK293细胞和您感兴趣的细胞的培养基,用于转染的lipofectamine等试剂以及适当的抗生素(取决于您的抗生素抗性基因)慢病毒载体)。

靶向敲低的小RNAs

由于用户友好的网络应用程序,如siRNA向导,BLOCK-iT™RNAi设计器,shRNA设计器等,它现在变得非常容易设计shRNAs。大学的核心设施也可根据您的喜好设计和合成shRNA。始终确保包含带有shRNA的荧光标记,以便于检测受感染的细胞。一旦获得s​​hRNA,最好使用midi或maxi-prep,为即将进行的实验提供足够的产品。

你的HEK293细胞快乐吗?

保持细胞良好状态至关重要。当细胞达到约80%汇合时,应定期检查细胞并进行分裂。HEK293细胞快速生长并快速胰蛋白酶消化,因此不允许HEK293细胞在胰蛋白酶中长时间孵育(30-60s应该这样做),或者您可能见证大细胞死亡。在接种转导实验之前,应将从冷冻原种中解冻的细胞传代至少两次。另一个需要记住的重要事项是,当细胞容易分离时,要非常温和地处理含有细胞的菜肴。对于转染实验,HEK293细胞应以约5×10 ^ 6个细胞/ 10cm培养皿接种,或者以第二天早晨(转染当天)细胞约40-50%融合的方式接种。

打包转换

下一步是将慢病毒载体质粒与病毒包装载体一起包装到脂质体中以递送到HEK293细胞中。

重要的是使用OptiMEM等无血清培养基作为实验的包装部分。无血清培养基增强了DNA与阳离子脂质体的复合物形成,并通过提高转染效率。有关更多信息,请参阅此处和此处!

将500μlOptiMEM培养基加入两个标记为管A和管B的1.5 ml管中。

试管A

:加入60μlLipofectamine

管B

:将质粒与shRNA和包装质粒的等比例添加到管中:10ug shRNA,5ug编码gag和pol的质粒,和5ug编码rev的质粒。

轻轻敲打混合管,闪蒸,并在室温下孵育10分钟。

将管B的内容物逐滴添加到管A中,轻轻地轻弹管,闪蒸,并在室温下孵育45分钟

在此阶段,将HEK293细胞上的培养基更换为5ml OptiMEM培养基

现在我们已经有了shRNA,包装质粒和lipofectamine的转染混合物,现在是时候开始包装了。

用HEK293细胞倾斜培养皿,并将转染混合物逐滴加入收集的培养基中。在这一点上,如果你不温柔,你可以看到HEK细胞变得不快乐和驱逐。因此在添加转染混合物时请务必小心。

一旦加入溶液,小心旋转平板以混合培养基并将转染混合物均匀分布到细胞上。

将细胞在无血清培养基中孵育5-8小时。孵育后,轻轻吸出培养基(这将包含任何不转染HEK293细胞的含有质粒的脂质体),并在培养板侧面加入10ml完全培养基,使细胞不分离。HEK293细胞将shRNA包装到病毒颗粒中并将其释放到培养基中。从这一点开始,媒体将富含病毒颗粒,因此在处理时应佩戴适当的PPE。48小时后收集培养基(病毒颗粒),并将10ml新鲜的完全培养基加入同一平板中。72小时后再次收集培养基并与48小时收集的培养基合并。通过使其通过0.45微米过滤器以使病毒流过,对合并的收集的培养基进行过滤灭菌。冻融循环会降低病毒的效力,所以制作2.5ml等份的病毒是个好主意。病毒可以在4°C下储存约一个月或两个月,在-20℃0C长期。始终使用漂白剂处理病毒生产过程中使用的移液器吸头和培养皿。在这里和这里阅读并学习更多关于病毒转导的知识!

让病毒进入细胞

现在我们已经感染了病毒,现在是时候感染靶细胞了。在大多数情况下,重要的是滴定您的病毒,以便您知道实验所用的浓度,并可以可靠地重复您的结果!

然而,在这种特殊方法中,我们的目标只是获得良好的击倒。这通过用病毒转导至少50%的细胞来实现。我们应该确保保持适当的比例以获得约50%的转导:

使用相同比例的病毒和细胞获得50%的转导。在15ml的管中,重悬约2百万个细胞(1/4个在2.5毫升完全培养基汇合10cm培养皿的)。到相同的管中,病毒的2.5毫升(1/4个从一个10cm培养皿中获得的总病毒)和15ug /加入ml聚凝胺的。Polybrene3通过中和病毒颗粒和细胞膜之间的电荷来增强转导效率。但是,确切的机制尚不清楚。

轻轻混合并将细胞放入新的10cm培养皿中。等待24小时后再换成没有病毒的新鲜完全培养基。如果shRNA构建体含有荧光标记,则可以检查转染后48小时整合的成功率;如果没有,继续选择抗生素48小时。我通常在星期三开始转导,因此可以在周末选择细胞。

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