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量化细胞自噬的正确方法

就像你需要不时清理你的房间一样,你的细胞也需要做一些家务。您的细胞通过称为自噬的过程实现这一目标。自噬主要起两种作用。首先是去除有害物质,如错误折叠的蛋白质,功能失调的细胞器和外来入侵者。第二种是在饥饿期间将细胞材料分解为能量。

为什么自噬很重要?

自噬调节不当是许多疾病的潜在因素,例如癌症,糖尿病,肝病,自身免疫疾病和感染。它不仅可以去除有害物质,还可以刺激衰老,帮助细胞在其表面产生抗原。研究人员已经开始认识到自噬是生理学和病理学中的重要过程。事实上,2016年的生理学或医学高贵奖属于Yoshinori Ohsumi,因为他在自噬方面的工作。

自噬机制

显示自噬的机制。 开始进行降解的细胞质蛋白质。 下图显示了吞噬细胞质蛋白的吞噬细胞。 第三组显示添加LC3-II的自噬体。 最后一组显示了具有与自噬体合并的降解酶的溶酶体,以形成自溶酶体。

数字。自噬的机制。礼貌Ryan Heck

当称为吞噬细胞的膜形成于细胞需要降解的材料周围时,自噬就开始了。同时,微管相关蛋白(LC3-I)与磷脂酰乙醇胺(PE)缀合,形成LC3-II。然后,LC3-II进入膜,促进自噬体的形成。自噬体与溶酶体融合以降解内部物质。LC3-II也同时降解,使LC3-II成为自噬的良好标记物。

通过测量通量来量化自噬

没有!

如果LC3-II是存在的自噬体数量的标记,我们是否可以运行蛋白质印迹并检测存在的LC3-II量以量化自噬? 自噬是一个动态过程 - 自噬体不断形成和消失。因此,LC3-II的水平可能意味着两种不同的东西。

让我解释。如果你看到蛋白质印迹中LC3-II增加,那可能意味着细胞自噬增加,因为有更多的自噬体。然而,它也可能意味着细胞自噬减少,因为某些东西抑制了自噬体的降解。如果您发现LC3-II减少,情况也是如此。这可能意味着形成更少的自噬体(更少)但它也可能意味着更多的自噬体被溶酶体降解(更多)。

因此,量化自噬的最佳方法之一是测量自噬通量。这是多少自噬体形成然后变质。要测量通量,您需要检测LC3-II转换,或存在与溶酶体抑制剂不存在时LC3-II水平的差异。

自噬通量= LC3-II水平(含抑制剂) - LC3-II水平(不含抑制剂)

不同类型的溶酶体抑制剂

您可以从许多不同类型的溶酶体抑制剂中进行选择,以测量自噬通量。以下是目前最常用的一些内容:

巴弗洛霉素A1:抑制自噬体和溶酶体的融合

氯化铵或氯喹:改变溶酶体的pH值,抑制溶酶体酶的降解活性

E64d +胃蛋白酶抑制剂A:抑制溶酶体酶

我们用什么来最终测量LC3-II水平?

如果您正在使用细胞培养,一种选择是裂解细胞,运行蛋白质印迹,并用抗体检测LC3-II。您还可以使用稳定表达GFP-LC3的细胞系并计算细胞上存在的斑点。如果您正在寻找体内实验,GFP-LC3转基因小鼠也存在。

自噬是一个动态过程

重要的是要观察自噬,而不是静态的,而是动态的过程。为了量化它,通过检测存在与不存在溶酶体抑制剂时LC3-II水平的差异来测量通量。对于细胞培养,不要忘记您的对照,因为每次治疗需要两个孔,一个有一个,一个没有抑制剂。

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