想象一下，您想要测试抗菌治疗在抑制某种细菌病原体方面的效率。作为实验的一部分，将细菌暴露于处理中，并通过计算培养基上形成的菌落形成单位(CFU)的数量来监测微生物的可培养性。如果微生物对处理敏感，CFU数将随着时间稳定地减少，直到最终没有观察到CFU。你感到高兴，因为看起来细菌被抑制了，从而证实了治疗有效的假设。但是庆祝活动还为时尚早吗?

已经表明，在许多不利的环境条件下，例如紫外线辐射，营养饥饿和抗生素处理，几种细菌可以进入可存活但不可培养的(VBNC)状态。VBNC细菌首先被环境微生物学家Rita Colwell及其合作者认可，具有非常低的代谢活性，不会在营养培养基上生长。过渡到这种休眠状态是细胞在致命压力下存活的策略，直到它们在条件变得更有利时复苏。VBNC细菌是细菌世界的僵尸!

我们为什么要关注这些细菌僵尸?

与可培养的细菌相比，VBNC细菌通常对抗生素和其他环境胁迫具有更强的抵抗力，使其能够持续存在并在以后重新激活。由于VBNC细菌不能在营养培养基上生长，因此基于培养的方法常常低估了它们的存活率。VBNC状态的致病菌对公共健康和食品安全构成威胁，因为它们可能逃避常规的微生物检测。一些致病细菌能够在VBNC状态下引发感染，而其他致病细菌不具有毒性，但在复活时恢复其致病性。当粪便指示菌(FIB)进入VBNC状态以响应环境中的压力时，也可能无法通过基于培养的方法准确地量化指示菌。

我们如何检测VBNC细菌的存在?

通过定量实时PCR：

分析方法如PCR和定量实时PCR(其测量RNA或DNA的变化)或代谢测定/染色最常用于计算VBNC细菌，因为它们的可用性和易用性。mRNA是生存力的优选标记，而不是DNA，因为它在细胞过程中合成并具有短的半衰期。从细菌中提取mRNA并通过逆转录转录成cDNA。随后，进行qPCR以量化基本管家基因如16S rDNA和rpoS的表达，其编码Sigma S转录因子。如果细菌处于VBNC状态，这些基因将以与活细菌相似的水平表达，即使在培养基中接种细菌时没有观察到可见的生长。使用标准曲线定量样品中存活细菌的数量，该标准曲线将基因表达与细菌数量相关联。当细菌活力受损时，这些基因将以显着较低的水平表达。需要在开始时提取足够量的mRNA以获得良好的qPCR读数。对于细菌数量非常低的样品(例如环境样品)，可以通过在提取前过滤和浓缩细菌来获得足够的mRNA。

通过评估代谢活动：

区分活细菌和死细菌的分析/染色通过测量代谢活动(例如呼吸)或细胞特征如膜完整性来实现。广泛使用的鉴别活细菌和死细菌的染色的实例是活/死BacLight细菌活力试剂盒(Molecular Probes)。绿色荧光SYTO®9和红色荧光碘化丙啶用于染色细菌细胞核。SYTO®9可以渗透活细菌和死细菌，而碘化丙锭只能进入受损膜的死细菌。当使用两种污渍时，碘化丙锭会降低死细菌中的SYTO®9荧光。因此，具有完整膜的细菌发出绿色荧光，而具有受损膜的死细菌发出红色荧光。然后可以通过荧光显微镜直接计数可存活和死亡的细菌，使用荧光酶标仪或流式细胞仪进行定量测定。仍然活着的VBNC细菌会发出绿色荧光。注意哪些可能影响染色结果的一些重要因素是SYTO®9与活细胞和死细胞的差异结合，SYTO®9的漂白和背景荧光。尽管如此，通过正确的控制和预防措施，SYTO®9和碘化丙锭染色仍然是量化VBNC细菌的有用技术。

因此，下次当您注意到细菌培养物没有生长时，不要认为它已经死了!